7.1 簡介
盡管本指南大體上集中在氨基酸分析的初始步驟（重點在水解樣品制備），但本節(jié)還是簡要討論了氨基酸分析中更常用的定量方法。在這些示例中，我們獲得了氨基酸分析結(jié)果；分析中需要計算原始樣品濃度。在這些示例中，我們假設(shè)已使用AccQ•Tag或AccQ•Fluor試劑進行了衍生化處理。
在進行定量之前：
驗證是否已正確鑒別所有峰。
如果保留時間不匹配，請檢查校正表中的值。
檢查所有峰的積分是否正確。
7.2 氨基酸的絕對定量
7.2.1 樣品中蛋白質(zhì)的濃度
在某些分析中，分析目標(biāo)只是測定分析樣品的濃度。測定結(jié)果通常以摩爾濃度表示，例如µmol/L。色譜結(jié)果通常以皮摩爾為單位。要測定濃度，請將色譜軟件報告的氨基酸皮摩爾量除以進樣體積，然后將該值乘以稀釋劑體積，再除以衍生化體積。將該值乘以稀釋因子，然后將單位換算為µmol/L，計算完成。
計算示例：
要確定原始樣品中氨基酸的濃度，請將報告的值用于以下公式：
其中：
pmol AA = 樣品中氨基酸的報告量
Vi = 進樣體積(µL)，通常為1 µL
Vd = 衍生化體積(µL)，通常為10 µL
Vr = 用于復(fù)溶樣品的稀釋劑的體積(µL)
Dil. Factor = 稀釋因子
示例：
將初始的100 µL水解蛋白質(zhì)樣品用內(nèi)標(biāo)按1:1稀釋。將10 µL等分試樣進行衍生化處理。進樣體積為1 µL，天冬酰胺(Asn)的報告值為312.5 pmol。
Asn的濃度(µmol/L)為：
7.3 氨基酸的相對定量
水解蛋白質(zhì)中氨基酸組分的測定涉及樣品中組分摩爾比的計算。
每種純蛋白質(zhì)對其中包含的每種氨基酸均具有特定的殘基化學(xué)計量數(shù)。理想情況下，分析結(jié)果得到的摩爾比為整數(shù)。觀測值接近該理想值的程度受蛋白質(zhì)或肽的純度、水解條件是否充分，以及氨基酸分析質(zhì)量的影響。
7.3.1 計算肽組分
示例1（如下表所示）：
將各氨基酸的觀測皮摩爾量（從分析中獲得）列成表格。
檢查并估算各氨基酸的殘基數(shù)（估算組分）。注意：觀察到的殘基是每種氨基酸的相對摩爾濃度。將所有觀測皮摩爾值除以豐度最低的氨基酸摩爾量，并四舍五入到最接近的數(shù)字。
將所有氨基酸的皮摩爾值和殘基數(shù)相加。
將觀測總皮摩爾數(shù)除以估算組分的總和來計算每個殘基的平均pmol（pmol/殘基）。
將每個觀測皮摩爾值除以pmol/殘基值以確定觀測組分。
平均pmol/殘基
警告：對于較大的蛋白質(zhì)，由于需要更高的精度，因此更難以估算殘基數(shù)。
警告：某些氨基酸的水解回收率可能會變化（Ser、Tor、Tyr和Met會降解；Val和Ile鍵可能難以斷裂）。
注：為了在這類情況下改善定量，建議進行時程研究。通常，可將樣品水解24 h、48 h和72 h（或96 h）；不穩(wěn)定的氨基酸值可通過外推回零時間來確定，而Ile和Val的值可從時間最長的水解中獲得。
示例2：
在一些情況下，如前所述，可以使用摩爾百分比（每100個蛋白質(zhì)殘基中各氨基酸的殘基數(shù)）計算結(jié)果。測定方法如下：
7.3.2 估算蛋白質(zhì)分子量
如果可以估算蛋白質(zhì)的分子量，則可以使用兩種方法來計算大致組分：
7.3.2.1 基于氨基酸大小和總產(chǎn)物量計算組分
估算的樣品分子量(MW)。
將氨基酸的總產(chǎn)物量相加(pmol)。
將分子量除以110（氨基酸的平均分子量）。注：由此可計算得出非常接近總鏈長或氨基酸總量的值。
將總產(chǎn)物量除以鏈長（等于進樣的摩爾量）。
將每種氨基酸的量除以進樣的摩爾量（等于每摩爾的殘基數(shù)）。檢查該值與整數(shù)量的偏差。
稍微向上或向下調(diào)整除數(shù)（進樣的摩爾量），盡可能減小與整數(shù)值（步驟5中獲得）的偏差。可利用計算機電子表格程序或?qū)俣ㄖ频陌被彳浖页鲎钚∑?，簡化該步驟。
請記住，由于水解回收率低，不穩(wěn)定的氨基酸和穩(wěn)定鍵合形成物的值可能會顯著偏離整數(shù)值。
7.3.2.2 基于歸一化至單個氨基酸計算組分
這種替代方法需要有關(guān)樣品的更多知識。
在分析中選擇滿足以下兩項標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸：
在水解和衍生化時產(chǎn)率高（例如，Asp、Glu、His、Arg、Ala、Pro、Leu、Phe、Lys）。不建議選擇Gly，因為它是一種常見的背景污染物；
每摩爾樣品可能僅含有幾個殘基（基于估算的樣品分子量和氨基酸產(chǎn)量）。這些信息可以從其他方法中獲得，例如溴化氰水解，溴化氰可在蛋氨酸處選擇性地切割完整的多肽鏈。
基于這些信息，為該氨基酸選擇一個整數(shù)值。
將所選氨基酸的產(chǎn)量除以所選整數(shù)值，即可得到估算的進樣摩爾量。
按照第7.3.2.1節(jié)步驟5和6操作。
檢查得出的值（一個小于和一個大于所選整數(shù)的值），確定它們與整數(shù)的偏差是否減小。
7.3.2.3 計算肽/蛋白質(zhì)濃度
將每個氨基酸的皮摩爾數(shù)與其相應(yīng)的分子量的乘積相加，計算原始樣品中肽或蛋白質(zhì)的濃度。
使用第7.3.1節(jié)表格中引用的示例，開始按照以下方法計算：
計算示例：
對于樣品中的Asp（天冬酰胺）：分子量為133.10 g/moL的氨基酸的觀測含量為220皮摩爾，如下所示：
對于其他所需的氨基酸，該計算方法也適用。下表顯示了計算得出的每種氨基酸的皮克數(shù)值，右下角顯示了樣品中進樣的蛋白質(zhì)的皮克數(shù)值總和。
注入蛋白質(zhì)的皮克數(shù)總和
7.4 飼料中氨基酸的定量分析
在食品和飼料分析中，上述計算值也適用。然而，對大多數(shù)飼料分析而言，更重要的信息是一些特定的、限制動物生長的氨基酸（例如蛋氨酸和半胱氨酸）含量。最常引起關(guān)注的值是樣品中的氨基酸含量（重量百分比）。
7.4.1 計算食品/飼料中氨基酸的重量百分比
要計算氨基酸的重量百分比：
計算示例：
步驟1：將報告的氨基酸摩爾濃度換算為報告的含量(g/mL)。
報告的含量值(pmol/µL)須乘以殘基分子量(gm/mol)和換算系數(shù)。
步驟2：將報告的每種氨基酸的含量換算為重量。
然后將報告的含量(g/mol)乘以稀釋因子。再將結(jié)果除以樣品的重量并乘以100，即可換算為重量百分比。
計算示例：
其中：
含量 = 氨基酸的含量，g/mL
稀釋因子 = 樣品稀釋因子
步驟3：將報告的每種氨基酸的含量換算為重量百分比。
樣品重量以mg為單位
7.4.2 官方AOAC方法994.12"飼料中的氨基酸"：計算樣品中氨基酸的重量百分比
該方法需要使用內(nèi)標(biāo)。
計算示例：
步驟1：計算每種氨基酸的響應(yīng)因子(RFaa)。
將內(nèi)標(biāo)的峰面積乘以氨基酸的重量(mg)。然后將計算值除以氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)重量相乘的值。
其中：
RFaa = 氨基酸的響應(yīng)因子
Pn = 內(nèi)標(biāo)的峰面積
Paa = 樣品中氨基酸的峰面積
Waa = 氨基酸重量(mg)
Wn = 內(nèi)標(biāo)重量(mg)
步驟2：計算內(nèi)標(biāo)(IS)因子。
步驟3：確定氨基酸的重量百分比。
開始計算含量百分比：將氨基酸峰面積乘以計算出的響應(yīng)因子，然后將該值乘以內(nèi)標(biāo)因子。將結(jié)果除以內(nèi)標(biāo)峰面積和分析樣品重量的被乘數(shù)。然后將結(jié)果值換算為百分比。
其中：
Paa = 氨基酸峰面積
Pn = 內(nèi)標(biāo)峰面積
RFaa = 計算出的響應(yīng)因子
IS = 計算出的內(nèi)標(biāo)因子
示例：
對于飼料樣品中的氨基酸，已確定以下值：
氨基酸重量(Waa) = 0.5 mg
氨基酸峰面積(Paa) = 100,000
內(nèi)標(biāo)峰面積(Pn) = 110,000
內(nèi)標(biāo)重量(Wn) = 0.5 mg
待測樣品的重量(Ws) = 10 mg
步驟1：計算響應(yīng)因子(RFaa)：
步驟2：計算內(nèi)標(biāo)因子(IS)：
0.5 mg × 2 × 10-2 = 0.05
步驟3：通過計算出的兩個值，即可確定氨基酸的百分比：
在飼料中，目標(biāo)氨基酸的重量百分比為0.9%。
